De gescheiden Larry Daley (Ben Stiller), heeft ondanks zijn vasthoudende pech in het leven, het gevoel dat er iets groots staat te gebeuren. Hoe groot, weet hij zelf ook niet, totdat hij met enige tegenzin een baan als nachtbewaker in het Historisch Museum accepteert. Al tijdens zijn eerste dienst wordt het hem duidelijk dat hij wel eens een cruciale rol in de wereldgeschiedenis kan gaan spelen. ‘s Nachts gebeuren er in het museum wel heel eigenaardige dingen .... iedereen en alles komt tot leven!!
Met de wijze woorden 'Don’t let anything in or out!' en de hulp van het wassenbeeld van President
Teddy Roosevelt (Robin Williams) probeert Larry de vechtende Romaanse gladiatoren en Amerikaanse cowboys weer op gelijke voet te krijgen en de rondrennende T-Rex bewijst voor eens en voor altijd waarom hij bekend staat als het gevaarlijkste roofdier ter wereld. Larry zal de samenzwering binnen het museum op moeten lossen om ervoor te zorgen dat de deuren niet voorgoed zullen sluiten.
